| L'objectif de cette thèse consistait à accroître les connaissances sur les plasmides et le métabolisme des sucres chez les lactocoques afin de mettre au point un nouveau vecteur pour la modification génétique des souches de Lactococcus lactis utilisées pour la fabrication de produits laitiers fermentés. Ainsi, des réplicons de plasmides naturels de L. lactis ont été identifiés et caractérisés puis un marqueur et une méthode de sélection ont été développés. Ces deux éléments ont ensuite été réunis pour constituer un outil de biologie moléculaire applicable à l'industrie alimentaire.; La séquence complète de trois plasmides naturels de L. lactis a d'abord été établie et analysée. Ces plasmides montrent une organisation génétique similaire basée sur des réplicons de type thêta, qui sont adaptés pour la construction de vecteurs plasmidiques de haute stabilité. Parallèlement, plus de 12 kb du génome de Lactococcus raffinolactis, une bactérie lactique possédant la propriété de fermenter les alpha-galactosides, ont été séquencés. Le gène de l'alpha-galactosidase de L. raffinolactis, aga, a été retrouvé au sein d'un opéron codant également pour deux enzymes de la voie de Leloir de dégradation du galactose. L'expression aga est entre autres contrôlée par un répresseur transcriptionnel de la famille LacI/GalR codé par un gène localisé en amont de l'opéron, gal R.; Le gène aga de L. raffinolactis a été associé au réplicon &thgr; du plasmide de L. lactis pSRQ800 afin de construire le vecteur de clonage de grade alimentaire pRAF800. Ce vecteur a été transféré par électroporation dans des souches de L. lactis. La sélection des transformants a été réalisée grâce à la capacité de fermenter le mélibiose conférée par le marqueur aga. Ce phénotype implique le transport du mélibiose dans le cytoplasme par une perméase endogène de L. lactis, GalA, et l'initiation subséquente de son métabolisme par le produit de aga. La fonctionnalité de pRAF800 a été démontrée en y insérant un gène de résistance aux bactériophages et en transférant la construction résultante dans une souche industrielle de L. lactis. La croissance de la souche modifiée n'a pas été affectée par la présence du vecteur, qui y était maintenu de façon stable. |
