Expression Of Fusion Protein Of Newcastle Disease Virusand Development Of Its Of Monoclonal Antibodies

用RT-PCR方法从新城疫病毒(NDV)标准强毒株F48E8扩增出融合蛋白(F)基因,并将其克隆到pGEM-T载体,命名为pGEM-NDF。经测序正确后,以BamHI和XbaI双酶切将F基因从pGEM-NDF中切下并插入到杆状病毒转移载体pFast Bac1中,得到重组转移载体pFastBac1-NDF;将该载体转座含有杆状病毒穿梭质粒的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,筛选出重组穿梭质粒rBacmid-NDF,并转染Sf9昆虫细胞,获得了重组杆状病毒reBac-NDF;间接免疫荧光(IFA)和免疫印迹(Western-blot)结果表明,新城疫病毒F48E8株F蛋白在昆虫细胞中获得高效表达。以重组杆状病毒reBac-NDF感染昆虫细胞72-96hr,收获细胞,腹腔免疫BalB/c小鼠。取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,用感染了NDV F48E8株的CEF进行IFA检测杂交瘤细胞上清,筛选出5株分泌抗NDV F蛋白的阳性杂交瘤细胞株,分别命名为NDV-F1D10,NDV-F2F12,NDV-F4D9,NDV-F6C4,NDV-F5C6;经过亚克隆后,所有杂交瘤细胞均保持了分泌抗体的能力;效价测定结果表明,单抗腹水IFA效价分别为1:1600,1:1600,1:1600,1:3200,1:800; IFA显示五株单克隆抗体能与野鸭源NDV和Lasota株感染的CEF反应,均不与MDV,REV,IBDV感染的CEF反应,证明所得的五株单抗是针对NDV F蛋白的特异性单抗,抗NDV F蛋白单抗的获得为NDV F蛋白的相关研究提供了良好的材料。用五株抗NDV F蛋白的单抗检测两种重组MDV CVI988转移载体质粒pucUS10-NDF和pucUS10-eGFP-IRES-F转染COS-1细胞,结果5株单抗中有两株单抗NDV-F1D10和NDV-F2F12 IFA在IFA中呈现亮绿色荧光,表明单抗NDV-F1D10和NDV-F2F12能识别COS-1上暂态表达的F蛋白,可以用于表达F蛋白基因工程苗的检测。...