Etudes cinetiques et structurales d'un ribozyme en 'tete de marteau' et d'un ribozyme dependant du plomb

La decouverte, au debut des annees 1980, d'ARN possedant une activite catalytique a notamment permis l'emergence d'un nouveau paradigme sur l'origine de la vie sur la Terre, l'hypothese d'un monde a ARN, ainsi qu'un jaillissement de nouvelles questions dans le champ d'etudes sur l'ARN. Comment un ARN peut-il catalyser une reaction chimique? Est-ce que son mecanisme catalytique est tres different de celui des enzymes proteiques? Quelle structure doit-il adopter pour cette fonction? Pour etudier les relations structurelfonction chez certains ribozymes, nous avons utilise des analogues de nucleotides contenant des deletions ou des modifications de groupements fonctionnels precis. Ces nucleotides modifies peuvent etre incorpores par synthese chimique dans la sequence d'un ribozyme puis leur impact sur l'activite catalytique peut etre mesure. Cette approche a l'avantage d'avoir une resolution plus precise que la mutagenese dirigee classique puisque seul l'effet de la deletion d'un groupement fonctionnel sur l'activite du ribozyme est etudie. Cette technique est particulierement utile avec des ARN catalytiques de petites taille, faciles a synthetiser, comme le ribozyme en "tete de marteau" et le ribozyme dependant du plomb.;Les premieres etudes furent effectuees sur les groupements 2' hydroxyles du ribozyme en "tete de marteau". Ce ribozyme perd completement son activite lorsqu'il est sous la forme dADN. Cependant, l'incorporation de ribonucleotides a certaines positions precises dans la sequence consensus du ribozyme en ADN permet de recuperer une partie de l'activite. Un "nucleozyme", c'est-a-dire un ribozyme compose d'un polymere mixte ribo et desoxyribonucleotide, contenant quatre ribonucleotides possede 0.1% de l'activite du ribozyme en ARN, alors qu'avec sept ribonucleotides, pres de 1% de l'activite est retrouvee (Chapitre 1). Bien qu'etant moins actifs qu'un ribozyme tout en ARN, ces "nucleozymes" sont neanmoins 1000 fois plus stables en presence de ribonucleases, ce qui en font d'interessants candidats pour une utilisation in vivo comme outils genetiques.;Cette etude a ouvert la voie a la creation d'un oligodesoxyribonucleotide, issu du site actif du ribozyme en "tete de marteau", et possedant une activite catalytique (Chapitre 2). Cet "ADN catalytique" est constitue d'une partie de la sequence consensus du ribozyme en "tete de marteau" et peut recreer le domaine catalytique entier en liant un substrat en ARN possedant le restant de la sequence consensus. Ce complexe ADN-ARN, en presence de cations magnesium, conduit au clivage du substrat en ARN. Cette experience constitue l'une des premieres demonstrations que l'ADN peut aussi posseder une activite catalytique.;Ces etudes, ainsi que celles effectuees dans d'autres laboratoires, ont permis l'identification des groupements fonctionnels essentiels a l'activite du ribozyme en "tete de marteau". Cependant, leurs fonctions dans la formation de la structure de ce ribozyme est restee inconnue jusqu'a la publication recente de structures cristallographiques du ribozyme en "tete de marteau". Au chapitre 3, une analyse comparative des donnees de mutagenese avec des nucleotides modifies a ete faite avec les structures cristallographiques. Il en ressort que la grande majorite de ces groupements fonctionnels sont impliques dans la formation des sites de liaison au magnesium. De plus, nous y proposons la presence d'un nouveau site de liaison au magnesium qui se formerait possiblement lors du repliement du ribozyme ou lors de l'etat de transition.;Le second ribozyme etudie dans le laboratoire est le ribozyme dependant du plomb qui utilise comme cofacteur le plomb pour cliver un lien phosphodiester specifique. Utilisant la technique de mutagenese avec des nucleotides modifies, nous avons identifie, sur les nucleotides formant le site actif, les groupements fonctionnels essentiels a l'activite de ce ribozyme (Chapitre 4). Parmi ces groupements fonctionnels, certains se sont reveles etre impliques dans la liaison cooperative de cations de plomb par le ribozyme.;Ces donnees furent utilisees comme contraintes pour construire un modele tridimensionnel du ribozyme dependant du plomb avec l'aide d'un programme de modelisation de structure d'ARN sur ordinateur (Chapitre 5). Le modele obtenu propose que trois nucleotides hautement conserves forment ensemble un triplet. Ce triplet se trouve etre implique dans la formation de deux sites de liaison du plomb, un site structural et un site catalytique. Au site catalytique, le groupement 2' hydroxyle adjacent au lien phosphodiester clive se retrouve proche de l'atome de plomb, ce qui a permis de suggerer un mecanisme catalytique permettant d'expliquer la reaction.