Functional and cellular studies of the form II Rubisco in the marine dinoflagellate Gonyaulax polyedra

Les dinoflagelles sont des organismes unicellulaires tres particuliers. Ils representent l'un des membres les plus importants du phytoplancton dans l'ecosysteme marin puisqu'ils sont a la base de la chaine alimentaire. La plupart d'entre eux possedent des plastes constitues par trois membranes, contrairement a ceux d'autres especes qui n'en possedent que deux. De plus, ils contiennent une forme II de Rubisco, une proteine clef dans la fixation du CO2. La Rubisco dite de forme II, comme son homologue, la forme I, catalyse la premiere reaction de carboxylation dans le cycle de Calvin ainsi que la premiere reaction d'oxygenation dans la photorespiration. En consequence, l'oxygene (O 2) est un inhibiteur competitif de la liaison du CO2 aux deux formes de Rubisco. A l'origine la Rubisco forme II fut decrite uniquement chez les bacteries anaerobies, d'ou la necessite d'investiguer le role de cette derniere dans les organelles generatrices d'oxygene. Chez Gonyaulax l'evolution de l'oxygene et la fixation du carbone varient selon des rythmes circadiens. La determination des niveaux proteiques de Rubisco, de l'evolution de l'O 2 ainsi que de la fixation du CO2 durant 48 heures indique que la fixation du carbone n'est pas due a un changement du niveau de Rubisco. Par contre, des analyses d'immunocytochimie montrent que l'activite rythmique de Rubisco se traduit par un changement de localisation a l'interieur de l'organelle. Ces observations suggerent que les plastes des cellules diurnes contiennent des regions de complements proteiques differentes des cellules nocturnes. C'etait la premiere evidence que l'activite circadienne d'une enzyme pouvait etre correlee a sa distribution dans l'organelle.;Finalement, j'ai decouvert une etape sensible a la Brefeldin-A (BFA) dans le rythme de fixation du carbone chez Gonyaulax . La BFA bloque le transport proteique a partir du Golgi et dans le cas des dinoflagelles, le transport proteique vers les plastes. Les experiences d'immunocytochimie sur des cellules traitees ou non a la BFA ont permis de demontrer que le blocage de l'importation de Rubisco nouvellement synthetisee vers les plastes perturbe la sequestration de celle-ci et par consequent la fixation de CO2. Les resultats presentes dans cette these montrent pour la premiere fois l'effet de la BFA sur les dinoflagelles et soulignent l'importance de la localisation d'une enzyme dans la regulation du rythme circadien.;La classe des dinoflagelles a elle seule est responsable d'une grande fraction de la production primaire des oceans. II est donc crucial de comprendre comment l'organelle photosynthetique est generee et maintenue dans ces organismes. Les precurseurs proteiques des plastes sont des peptides de transit bipartites. Ils contiennent deux domaines distincts: (i) une sequence N-terminale hydrophobe, similaire aux peptides signals des proteines ciblees au reticulum endoplasmique, (ii) une region caracteristique des peptides de transition des plantes superieures. Ainsi, le ciblage des proteines aux plastes des dinoflagelles se fait via des voies de secretion. J'ai demontre que le mecanisme de ciblage proteique a la membrane tripartite des plastes depend de leur structure et non de leur phylogenie.